マルチプレックスRT-PCR法を用いたキュウリに感染する７種ウイルスの迅速診断

キュウリに感染する７種類のウイルスは２セットのプライマーカクテルを用いたマルチプレックスRT-PCR反応で粗汁液からも同時に検出・同定できる。

キュウリには多種のウイルスが感染し、そのベクターはアブラムシ類、アザミウマ類、コナジラミ類及び接触・土壌伝染と多岐にわたる。そのため、防除対策を講じるためには、病原ウイルスの早期診断が必須である。そこで、キュウリモザイクウイルス（CMV），ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ZYMV），パパイヤ輪点ウイルス（PRSV），カボチャモザイクウイルス（WMV），メロン黄化えそウイルス（MYSV），ビートシュードイエロースウイルス（BPYV）及びキュウリ緑斑モザイクウイルス（KGMMV）の７種類ウイルスを同時に検出・同定できる診断法を開発する。

１．	プライマーは、既報の論文を参考にするとともに、DDBJ等のデータベースを利用して、ウイルスの遺伝子配列情報を収集し、２セットのプライマーカクテルを作成する（表１）。
２．	それぞれのプライマーの最終濃度は表１のとおりとする。テンプレートは、被検植物からのRNA抽出液、または、粗汁液を用いる。マルチプレックスRT-PCRはOne Step RNA PCR Kit(AMV)（TAKARA社）のプロトコールに従って実施する。逆転写反応は、50℃30分、94℃2分、PCR反応は、94℃30秒、54℃30秒、72℃１分を35回繰り返し、最終伸長は72℃10分間とする。
３．	本法を用いると、プライマーカクテルAでは、WMV、BPYV、ZYMV及びPRSVの単独感染植物から、それぞれ657bp、546bp、463bp及び330bpのDNA断片が増幅される（図１A）。プライマーカクテルBでは、CMV、MYSV及びKGMMVの単独感染植物から、それぞれ940bp、776bp及び463bpの断片が増幅される（図１B）。
４．	これまで３種ウイルスの自然重複感染株から検出できることを確認している（データ省略）。
５．	両プライマーカクテルを使用すれば、１検体につき２反応で、７種ウイルスのいかなる組み合わせの重複感染にも対応できる（図１A、B）。

１．	本プライマーセットは、現場対応を見据えた一次診断を目的として作成している。
２．	テンプレートに葉粗汁液を用いる場合は、100倍（w/v）程度に希釈する。
３．	2008年に新病害として報告されたウリ類退緑黄化ウイルスには対応しない。
４．	KGMMVのプライマーはスイカ緑斑モザイクウイルス（CGMMV）にも対応していることから、本法はメロンにも対応できる。
５．	本法は、TAKARA社のOne Step RNA PCR Kit(AMV)を使用した場合の設定条件であるため、異なる試薬を使用する場合には試薬ごとに反応条件を最適化する必要がある。

研究課題名：作物別のウイルス病診断システムの構築
予算区分：JSTシーズ発掘試験
研究期間：2007年度
研究担当者：宇賀博之