クライオトップでガラス化保存したウシバイオプシー胚のストロー内耐凍剤除去法

クライオトップ(CT)を用いてガラス化保存したウシバイオプシー胚は、耐凍剤除去液を入れたストロー内にCTシート部を挿入、上下に振とうして、胚をストロー内に移行させることで、耐凍剤除去が可能である。0.3モル（Ｍ）Sucrose（Suc）を添加した20％子牛血清（CS）加199を耐凍剤除去液とした場合の受胎率は定法と同等である。

  通常、ガラス化保存胚を利用する場合、実験室内で熟練した技術者による耐凍剤除去処理が必要で、このことが野外普及の妨げとなっている。そこで、CTを用いてガラス化保存したウシバイオプシー胚を農家の庭先で利用するためのストロー内耐凍剤除去法を明らかにする。

１．	生体から回収した胚を性判別目的で約20％の細胞を採取後、CT法で保存したものについて、耐凍剤除去液を充填したストロー（38℃に加温）にCTのシート部を挿入（図１）し、30秒、上下に振とう後、CTをストローから取り出し、更に２分30秒かけて耐凍剤除去を行う。この際、シート部を30秒間上下に振とうすることで、すべての胚がストロー内に移行する（表１）。ストロー内の耐凍剤除去により、胚の生存性は損なわれない（表１）。
２．	0.3ＭSucを含む20％CS加199を用いたストロー内耐凍剤除去後、30分放置後の胚の生存性は、Suc濃度が0.5Mに比べ高い傾向にある（表２）。したがって、0.3MのSucを含む除去液を用いる場合は、移植に長時間を要しても、胚に対する障害が少ない傾向にある。
３．	0.3ＭSucを含む20％CS加199を耐凍剤除去液に用いて、ストロー内でCTシート部を30秒の上下振とうと２分30秒の耐凍剤除去操作（図１）をした後、CT法でガラス化保存したバイオプシー胚を移植することで、定法（実験室内段階除去法）と同等の受胎率が得られる（表３）。

１．	耐凍剤除去液を入れるストローの口を広げ、CTのシート部が挿入しやすいようにするストロー加工が重要である。
２．	保管器から取り出し、ストロー内耐凍剤除去するまでの手技に迅速性が求められる。

［具体的データ］

研究課題名：性判別ガラス化保存胚の簡易移植法の検討
予算区分：県単
研究期間：2004〜2006年度
研究担当者：佐野文彦、齋藤美英、赤松裕久、永田浩章、土屋貴幸、笠井幸治