新たな豚受精卵のガラス化保存技術（MMV法）の開発

ステンレス製の小さな金網に、豚受精卵および凍結媒液を付着させて直接液体窒素中に浸漬してガラス化する方法（ＭＭＶ法）を開発した。この方法は、従来法と比較して、特別な器具を要さず、かつ、簡単に受精卵をガラス化保存できる。また、保存後に雌豚に移植することで良好な受胎成績が得られる。

  豚受精卵の凍結保存技術は、優良遺伝資源の長期保存と有効利用、疾病の防除および豚の輸送コストの大幅な削減に応用できる。しかし、従来法には、保存後の発生率が極めて低いという問題があり、技術の確立が望まれている。ところが、最近、受精卵を小量の溶液とともに直接液体窒素中で急速に冷却するガラス化技術により、高い発生率および移植後の受胎率が報告されている。しかし、この方法の多くには特殊な器具が必要で、手法が複雑である。そこで、特殊な器具を必要とせず、手法が簡単な超急速冷却法による豚受精卵のガラス化技術を確立する。

１．	豚受精卵としては、生後７〜８ヶ月齢の未経産豚にｅＣＧおよびｈＣＧ処理し、６日目（ｈＣＧ投与日＝０日目）の桑実期胚および７日目の拡張期胚盤胞を用いる。
２．	受精卵を7.5％エチレングリコール（ＥＧ）＋7.5％ＤＭＳＯ＋20％ＦＢＳ加ＰＢＳ液中で５分間平衡後、15％ＥＧ＋15％ＤＭＳＯ＋0.6Ｍトレハロース＋20％ＦＢＳ加ＰＢＳ液中に移して１分間平衡し、ステンレス製（目開き75µm）の金網（幅1.5mm、長さ８-10mmで、一方を垂直に３mm折り曲げた形状）ですくい金網に付着させた後、直接液体窒素中に浸漬して保存する（ＭＭＶ法）（図１）。
３．	金網を37℃に温めた0.5Ｍトレハロース＋20％ＦＢＳ加ＰＢＳ液に投入して、受精卵を融解し５分間平衡する。10％ＦＢＳ加ＮＣＳＵ37（培養液）中で受精卵を５分間平衡後、培養もしくは未経産豚（５日目）に移植する（図１）。
４．	ＭＭＶ法によりガラス化した拡張期胚盤胞の生存率は84.4％と高いが、桑実期胚では55.0％とやや低いことから、本法による豚受精卵の保存には拡張期胚盤胞が適している（表１）。
５．	ＭＭＶ法によりガラス化した受精卵の透明帯には、微細な亀裂が発生した（拡張期胚盤胞では28.1％、桑実期胚では10.0％）（表１）。
６．	ＭＭＶ法でガラス化した拡張期胚盤胞20個ずつを雌豚10頭に移植することにより、７頭が38頭（死産１頭を含む）の子豚を分娩したことから、豚受精卵の保存に利用できる（表２）。

１．	ステンレス製の金網は、安価で容易に手に入る。また、手法も簡単なため、広くこの技術を利用できる。
２．	桑実期胚は拡張期胚盤胞よりもガラス化後の生存率が低いため、新たな技術の開発が必要である。
３．	ガラス化後の胚の透明帯に亀裂が発生すると外部からの細菌などの侵入を受けるので、胚の取扱いには注意を要する。

［具体的データ］

研究課題名：豚受精卵移植技術確立試験
予算区分：県単
研究期間：2004〜2006年度
研究担当者：藤野幸宏、中村嘉之、小林博史