豚の振動型卵子採取装置および卵子洗浄回収装置の開発

振動型卵子採取装置、および卵子洗浄回収装置を作製し、その性能試験を実施した。これらの装置を用いることによって、従来の方法と比較し、それぞれ、単位時間当たりの卵子採取数が約3.8倍増加し、卵子回収・洗浄に要する時間が約半分に短縮される。

  近年、ブタの繁殖工学技術の中でも体外培養・胚操作技術の分野では、無血清培地下で体外培養したブタ胚による子ブタ作出の成功や、体細胞クローンブタ作出の成功、さらに遺伝子改変ブタの作出など、数々の成果が挙げられている。しかし、その成功率が極めて低いために、これら技術は未だ実用化までには及ばず、技術の改良が急務である。その技術改良には、素材となるブタ卵子・卵丘細胞複合体(COCs)を大量に必要とする。しかし、COCsの採取・洗浄作業は相応に作業者の時間と労力が必要とされ負担となっている。
  そこで本研究では、ブタCOCs採取・洗浄に係る時間と労力の短縮・低減を目的として、振動型卵子採取装置、および卵子洗浄回収装置を作製し、その性能試験を実施する。

１．	効率的なブタCOCs採取方法の検討として、振動型卵子採取装置を作製した(図１)。装置は、先端に剣山を装着した小型の振動機と卵巣を保持するシャーレからなり、剣山が振動して卵胞中のCOCsを回収液中に浮遊させる仕組みとする。使用方法は、培養液(0.3%BSA加修正TCM199)を満たした保持シャーレ内に卵巣を浸漬させ、ピンセットで保持しながら、振動した卵胞破砕機を押し当てて効率的に卵胞内のCOCsを浮遊させる。
２．	性能試験では、1分間あたりのCOCs採取数は、従来法の掻き出し、および吸引法を用いた場合、各々、37.4±5.3個/min、24.3±2.4個/minであったが、振動型卵子採取装置では、92.7±26.1個/minと、回収COCs数が最大3.8倍増加する(図２)。採取したCOCsの形態的特徴は、採取法の違いによる差は認められない。採取した卵子の修正NCSU37培養下の48時間後の成熟率は、従来法が各々65.1±10.9％、68.1±16.2％であったのに対し、採取装置では、74.1±8.3％であり、次いで発生培地PZM-5培養下での単為発生による6日目胚盤胞形成率は、従来法がそれぞれ、30.0±18.9％、および28.1±17.2％であったのに対し、採取装置では22.5±9.5%と、ともに有意な差は認められない(表１)。
３．	効率的なCOCs洗浄方法を目指して、卵子洗浄回収装置を作製した(図1)。回収装置は、底面にCOCsが通過できるメッシュサイズのメッシュをもつ内筒、および、COCsが通過できないメッシュサイズをもつ外筒、ならびに受け皿からなる。使用方法は、筒にCOCs浮遊液を通すことによって、COCsと大きさが異なる莢雑物が除かれCOCsが外筒のメッシュ上に捕獲される仕組みとし、外筒を培養液に満たされた受け皿に浸漬させることで、再浮遊され、シャーレに移して回収する。
４．	回収液(0.3%BSA加修正TCM199)中のCOCsの洗浄に要する時間は、従来法が318.3±59.0secであるのに対し、開発した装置を用いた169.7±40.4secであり、0.53倍に短縮される(図３)。

１．	ブタやその他の家畜のCOCs採取・洗浄に活用でき、作業者の時間と労力を短縮できる。

［具体的データ］

研究課題名：体細胞クローンブタの効率的作製と種ブタとしての有用性検証
予算区分：国庫
研究期間：2004〜2006年度
研究担当者：大竹正剛、河原崎達雄