ストローカット法による牛初期胚のガラス化保存

[背景・ねらい]

　胚をストロー内に封入する従来のガラス化法は冷却速度が遅く、高い生存率を得るためにはある程度の経験が必要である。最近、極少量のガラス化液に胚を浸漬し、超急速に冷却保存する方法が開発されているが、ガラス化後の胚の取り扱いが煩雑である。
　そこで、大量に作出されるウシ体外受精胚やクローン胚の保存方法として、さらに簡易的で再現性と生存性の高い保存技術を開発する。

[成果の内容・特徴]

1. ガラス化液は、20%エチレングリコール＋20%DMDSO＋0.3mショ糖を含む3mg/ml BSA添加PBSを用いた。凍結は斜めに切断した凍結用ストローの先端部分に胚を含む凍結液1μl でドロップを作り開放状態で直接液体窒素中に投入して行った（写真１）。
2. 体外受精胚を用いた発育ステージ別の生存率は、後期桑実期(CM)～初期胚盤胞期(eBla)（Ⅰ区）71.9%、胚盤胞期(Bla)（Ⅱ区）90.5%、拡張期胚盤胞期(ExBla)（Ⅲ区）92.6%であり、胚盤胞期以降で高い生存性を示した（表１、写真２）。
3. 体外受精胚を用いた培養方法別の生存率は、マウス胎子線維芽細胞と共培養した区（10%FCS-199(MFF)）93.3%、血清添加し非共培養した区（5%FCS-CR1aa）97.2%、無血清で非共培養した区（IVD101）90.5%であり、培養方法の影響を受けずに高い生存性を示した（表２）。
4. 体細胞クローン胚をストローカット法でガラス化保存した結果、生存率82.5%、脱出率42.5%であった（表３）。
5. ストローカット法によりガラス化保存したクローン胚を受胚牛に移植した結果、3頭中2頭が妊娠し、内1頭が241日目に流産、1頭が271日目に双子を分娩した（表４）。

[成果の活用面・留意点]

1. フラクチャー傷害が発生する場合があるので注意が必要である。
2. ガラス化保存胚を移植しデーター蓄積を図る必要がある。

[具体的データ]

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