PEP-PCR法を利用したウシ体外受精由来胚の性別とバンド3の遺伝情報診断

[背景・ねらい］

　反復配列の多い雄特異的DNA領域に対してPCR法を利用することにより胚の性別判定が実用化されている。一方、遺伝性疾病は単一配列であるため，診断には性別判定より多くの不純物の少ないDNAを必要とする。ウシ赤血球膜蛋白異常症(バンド3)を診断するためには胚の1/2が必要であり、さらに性を診断すると移植できる胚は得られない。
　そこで、性と疾病の両方を診断するために，ウシ体外受精7日目胚を切断後，胚サンプルにPrimer Extension Preamplification (PEP) ? PCR法 (冨永ら、2003)の応用を検討し、実用的な利用を考えて、ゲル・ローディング・チップ(GL-Tip)ガラス化保存法(Tominaga and Hamada, 2001)を用いて超低温保存した胚を移植して、受胎能と判定の正確さをみる。

[成果の内容・特徴］

1. バンド3をヘテロで保因する雄牛の精液と食肉センターで採取した卵巣由来卵子(フリー)とを体外受精し，高品質の7日目胚盤胞を試験に供する。
2. 切断刃で胚の1/4～1/3 (10～20個)を切断したサンプルを洗浄後、10μl水に入れたサンプルを95℃5分間熱処理してDNAを抽出し、15merランダムプライマー(OPERON)を用いたPEP-PCR法によりDNAを増幅し、SUPREC^TM-PCRキット(TaKaRa)でPCR産物を精製する。
3. 性別をXYセレクター(伊藤ハム)で判定し、並行して、バンド3を遺伝子型検査法(Inaba et al. 1996)で診断する。バンド3診断では、染色体のバンド3-DNAのナンセンス変異部に対応したプライマーを用いてPCRで増幅後、制限酵素DRAIIIでDNAを切断し、切断の有無でバンド3保因を調べる（図1）。
4. 2種類の遺伝子判定は94.8%(73/77)の胚で可能であり、バンド３保因:フリーは36:37と1:1であり、♂:♀は46:27と雄が多くなる傾向がある(P=0.08)(表)。
5. 胚の受胎能と判定の正確さをみるために，経腟採卵で採取したバンド3フリー卵子を成熟培養後、ヘテロ種雄牛精子と体外受精し、雄でバンド3フリーと判定した１個の7日目胚盤胞をGel GL-Tip法でガラス化し、18日間液体窒素で保存後移植した結果、判定どおりの雄でバンド3フリーの子牛(体重22.6Kg，妊娠期間283日)を生産した(図2)。

[成果の活用面・留意点］

1. 複数の遺伝情報を付加した優良牛の胚を有効利用できる。
2. PEP-PCRや遺伝子診断技術は高度な複合技術であるため、個々の技術を完全に習得する必要がある。

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