RT-LAMPによる数種作物からのトマト黄化えそウイルス（TSWV）の検出

[背景・ねらい］

　広島県では、媒介虫ミカンキイロアザミウマの分布拡大に伴い、キクを始め各種作物でTSWVの被害が発生している。TSWVの高精度の診断には、抗体を用いたELISAやウイルス核酸の増幅反応によるRT-PCR法が行われているが、検定に特殊な機材や時間を要する。LAMP法はNotomiら（2000）によって開発された新しい遺伝子増幅技術で、高い特異性と迅速性から、種々病原体の検出に利用され始めている。そこで、TSWVの感染対象となる主要な農作物からのRT-LAMP法によるTSWVの診断技術を確立する。

[ 成果の内容・特徴 ]

1. LAMPプライマーはTSWV M RNAのNSm遺伝子領域の塩基配列情報に基づき、TSWVNSm-F3（5´-F3-3´）、TSWVNSm-FIP（5´-F1c-F2-3´）、TSWVNSm-BIP（5´-B1c-B2-3´）、TSWVNSｍ-B3（5´-B3-3´）の4種のLAMPプライマーを設計し（図１）、増幅領域は152bpとする。なおF3、 F2、 B2、 B3の3´末端とF1c、B1cの5´末端6塩基に変異部分が含まれず、増幅領域内に制限酵素サイトHinfIおよびBsmIを含むようにする（図1）。
2. 凍結保存（－80℃）した各作物から総RNAを抽出し[SV Total　RNA Isolation systemR、（抽出時間約1時間）またはAquaPure RNA Isolation KitR、（抽出時間約30分）などを利用]、逆転写酵素を加え、LAMP法DNA増幅試薬キットRにより63℃、1時間反応させる。
3. TSWV発病キク、トマト、ピーマンからRT-LAMPによる増幅遺伝子が認められ、一方、いずれの植物の健全葉からも増幅遺伝子は認められない。さらに、近縁種のINSV発病インパチェンスから増幅遺伝子は認められない（図2）。
4. RT-LAMP産物を制限酵素処理すると、BsmIで210、219bp、HinfIで159bpのDNA断片に収斂されることから、RT-LAMP増幅産物はNSｍ遺伝子由来である(図3)。
5. RT-LAMP副産物の白濁を利用した検出方法とTSWVモノクローナル抗体を用いたDAS-ELISAの検出感度を、キク感染葉を健全葉で段階希釈して検討したところ、モノクローナル抗体を用いたDAS-ELISAではキク感染植物組織の0.75mg相当まで検出できたのに対し、RT-LAMPでは0.03mg相当まで検出でき、RT-LAMPの検出感度はDAS-ELISAのそれよりも約１オーダー高いものと判断される（図４）。
6. 以上から、試薬類と恒温槽の装備で、RT-LAMPを利用した核酸の増幅による簡易かつ迅速・高感度なTSWVの診断が可能である。

[成果の活用面・留意点]

1. キクでは水やTE緩衝液を用いた簡易抽出による核酸を用いた場合、検出が不安定であるので，核酸抽出には市販のキットを使うのが良い。
2. 遺伝子増幅量が膨大であるので、コンタミネーション防止のためLAMP増幅遺伝子産物の蓋は開けずに、増幅副産物による白濁（目視）で判定するのがよい。

［具体的データ］

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