研究項目及び実施体制(◎は総括研究代表者)
- ナノ領域の蛍光標識法の開発
(廣瀬玉紀(平成11～13年度)、田中 淳(平成14年度)/日本原子力研究所高崎研究所) - 試料の固定と光プローブ顕微鏡による蛍光ラベルの高感度検出
(◎大谷敏郎/独立行政法人食品総合研究所) - ナノFISH法のための光プローブ顕微鏡装置の最適化に関する研究
(村松 宏/セイコーインスツルメンツ株式会社)
研究の目的
従来のFISH(fluorescence in situ hybridization)法では、蛍光標識した遺伝子の位置を光学顕微鏡で測定するため、光学顕微鏡レベルを越えた測定は不可能であった。そこで本研究は、光学限界を超えた高分解能で高感度かつ効率的に遺伝子の位置情報を計測する新たな方法(ナノFISH法)を開発することを目的とした。
研究の内容
DNA上の特定塩基配列をFISH法で蛍光標識し(1.色をつける)、コーミング法あるいは新規な物理的方法で平坦な基板上に直線状に伸長・固定し(2.伸ばす)、極微小の開口を持つ光ファイバーを用いた走査型光プローブ原子間力顕微鏡(SNOM/AFM, Scanning near-field optical/atomic force microscope)にて、形状像および蛍光像を同時に取得・解析する方法(3.見る)を検討し、ナノFISH法の確立を目指した。
主要な成果
- DNA分子の特定塩基配列(5nm相当)を特異的に標識し、高効率で精製・回収するとともに、SNOM/AFMで観察可能な低ノイズ化、DNAの脱塩基部位の可視化に成功した。
- 基板上にπ共役化合物を含むポリマーをスピンコートし、DNAを吸い上げ法や液滴制御法などで直線状に伸長・固定することに成功した。さらに、マイカ基板上を分子レベルで平滑に保ったまま疎水化し、DNAを吸い上げ法にて伸長・固定する方法も確立した。
- SNOM/AFM装置と光プローブ探針をDNA観察用に改良・開発し、1本のDNAの形状像と蛍光像の同時計測および蛍光色素一分子の検出を可能にした。励起光源に多波長レーザーを用い、検出系にCCDカメラを用いた分光SNOM/AFMシステムを開発して、多種類の蛍光色素を同時に検出できる可能性を示した。
- 1から3の総合成果:DNA全体の形状像および蛍光像を同時に取得すること、および1本鎖DNAと2本鎖DNAを明確に区別することに成功した。また、DNA上の特定塩基配列を標識した蛍光色素の位置を初めて計測すること、および標識された蛍光色素一分子を約13nmの空間分解能で検出することにも成功した。
主な発表論文
- Kim, J. M., et al. : Simultaneous Topographic and Fluorescence Imaging of Single DNA Molecules for DNA Analysis with a Scanning Near_Flield Optical/Atomic Force Microscope : Analytical Chemistry, 73 : 5984_5991(2001)
- Otobe K., et al. : Behavior of DNA Fibers Stretched by Precise Meniscus Motion Control : Nucleic Acids Research, 29 : e109 (2001)
- Hirose T., et al. : Direct Visualization of Abasic Sites on a Single DNA Molecule Using Fluorescence Microscopy :Photochem Photobiol., 76:123_126 (2002)
- Nakao H., et al. : Development of Novel Polymer_Coated Substrates for Straightening and Fixing DNA : Nano Letters, 2 : 475_479(2002)
- Muramatsu H., et al. : Near-field Optical microscopy with Video Signal Processor to Apply a CCD Imaging Devices as a Variable Area Photo Sensor for Improving Operability and Spectrum Mode Imaging : Ultramicroscopy, 91 : 83_88(2002)
研究のイメージ
