アブラナ科野菜からの黒腐病菌、斑点細菌病菌の特異的検出法

要約

特異的プライマーを用いたmultiplex PCRとmultiplex nested PCRにより、アブラナ科野菜の種子や病斑から黒腐病菌と斑点細菌病菌を検出する手法である。選択培地を用いた手法では1週間以上要するのに対して1～2日で評価できるため、種子や病斑からの簡易検定に有用である。

  • キーワード:アブラナ科野菜細菌性病害、種子伝染性病害、特異的プライマー、Xanthomonas campestris pv. campestris、X. campestris pv. raphani
  • 担当:中央農業研究センター・病害研究領域・病害防除体系グループ
  • 代表連絡先:
  • 分類:研究成果情報

背景・ねらい

アブラナ科野菜において、黒腐病と斑点細菌病は、発病による経済的被害が大きい病害である。黒腐病はXanthomonas campestris pv. campestris(Xcc)、斑点細菌病はX. campestris pv. raphani(Xcr)という近縁な細菌によって引き起こされるが、病徴、発病の重症度および宿主範囲が異なるため、両者を識別することは病害の発生拡大を防ぐ上で重要である。また、いずれも種子伝染によって被害が拡大するため、国内での発生において種子伝染が疑われることがあり、種子や病斑からの病原細菌の簡便で迅速な検出手法の開発が求められている。さらに種子の輸出に際し、輸出相手国から種子伝染性病害に対する無病証明書が求められる場面が増えているが、通常、種子の検査証明書を得るためには、国際標準法に準拠した検査が行える機関において選択培地を用いた検査を行う必要があり、これには時間とコストが掛かるため、予めこれら病原細菌の混入を確認できれば時間とコストの無駄を省くことができる。しかし、細菌病害の種子検査においては、30,000粒の種子を10,000粒の3区に分け、種子浸漬液からの病原体検出が行われるが、浸漬液の容量が大きいため、僅かな病原菌の混入を検出するのは困難である。
そこで、本研究ではXccとXcrの遺伝子解析により、それぞれを識別できる遺伝子領域を特定し、特異的な検出を行える遺伝子マーカーを作製する。この遺伝子マーカーを用いて、種子や病斑から特異的な検出を行う手法を開発する。

成果の内容・特徴

  • XccではXcrと比較してセルロースの合成に関与すると考えられる遺伝子群の一部に欠失がある。この領域をターゲットととする、両者に共通のフォワードプライマー(pncB_fw1)、それぞれに特異的なリバースプライマー(Xcc_rv1、Xcr_rv1)を用いてmultiplex PCRを行うことでXccでは約770 bp、Xcrでは約1100 bpのDNAが増幅する(表1、図1)。本プライマーはXccとXcr以外の8属30種の植物病原細菌に対してDNAを増幅しない。反応液中に150～200コピー程度のターゲットとなるDNAがあれば増幅可能である。
  • さらに両者に共通のフォワードプライマー(pncB_fw2)、それぞれに特異的なリバースプライマー(xcc_rv2、Xcr_rv2)を用い、1.のPCR産物を鋳型に用いてmultiplex nested PCRを行うことで、Xccで約240 bp、Xcrで約360 bpのDNAが増幅する。multiplex nested PCRでは、反応液中に1コピーのターゲットとなるDNAがあれば増幅可能である。
  • 種子1000粒に1粒の汚染種子が混入したサンプルからも、multiplex nested PCRを行うことで、XccとXcrを識別しながら検出することが可能である(図2)。また、種子10,000粒中に50の汚染粒を含む、計算上は全体で3×104cfu程度の汚染についても検出できる。
  • 病斑1 cm2から抽出したDNAを鋳型にしてmultiplex PCRを行うことで、XccとXcrを識別しながら検出することができる(図3)。

成果の活用面・留意点

  • 高い検出感度を要しない場合は作業時間、コスト、簡便性等を考慮してmultiplex nested PCRを行うかどうか判断する。
  • 病斑によっては鋳型となる菌数が少ないため、multiplex PCRでは検出できないことがある。
  • 種子からの検出方法は種苗管理センターにおける「種子の健康作業方法書」として種子検査業務に活用する予定である。

具体的データ

図1 黒腐病・斑点細菌病菌用PCRの組成と温度条件,表1 特異的検出用プライマーの塩基配列,図2 健全種子1000粒に対してXcc 感染種子1粒(1-3)、Xcr感染種子1粒(4-6)、XccとXcr感染種子1粒ずつ(7-9)混入した種子の浸漬液から抽出したDNAに対するmultiplex PCR(上)とmultiplex nested PCR(下)によるDNAの増幅,図3 Xcc罹病葉から分離したDNA(1-2)、Xcr罹病葉から分離したDNA(3-4)、無病徴の葉から分離したDNA(5-6)に対するmultiplex PCR

その他

  • 予算区分:交付金
  • 研究期間:2016～2020年度
  • 研究担当者:井上康宏、染谷信孝、窪田昌春、松田輝子、大﨑康平
  • 発表論文等:
    • 井上、特願(2020年2月4日)
    • Inoue et al. (2021) Appl. Microbiol. Biotechnol. 105:1991-2002