リンゴさび果ウイロイドのRNAプローブによる遺伝子診断法

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要約

DIG標識RNAプローブを用いたリンゴさび果ウイロイド(ASSVd)の遺伝子診断は、リンゴ樹の樹皮を検定試料として用いることにより、一度に多数の診断が行え、検出感度も高く、実用性の高い診断法である。

  • 担当:果樹試験場・リンゴ支場・病害研究室
  • 連絡先:成果情報のお問い合わせ
  • 部会名:果樹
  • 専門:作物病害
  • 対象:果樹類
  • 分類:普及

背景・ねらい

リンゴさび果病病原体のASSVdの検定法として、放射性同位元素標識の核酸プローブを用いた遺伝子診断法があり、高感度な診断法と して知られているが、特別な施設を必要とする。近年、DIGやビオチンを標識した非放射性標識DNAプローブによる遺伝子診断法が一般化しつつあるが、さ らに高感度であるといわれるRNAプローブ(DIG標識)を用い、ASSVdの迅速で、高感度の診断法の開発、実用化を行った。

成果の内容・特徴

  • プラスミドベクターの pBluescript II SK(-)のHinc II サイトにASSVdの全長のcDNAが組み込まれたクローンを用い、T3あるいはT7DNA依存RNA合成酵素によりDIG標識cRNAプローブを作製 し、ASSVd感染リンゴ樹から抽出した核酸試料を、ナイロンメンブレンにスポットし、ドットブロットハイブリダイゼーションによりASSVdを検出でき た。
  • ASSVd感染樹「印度」のさび果症状を示す果実及び健全「印度」果実の果皮を用いて検出を行ったところ、感染樹から抽出された核酸試料にのみシグナルが検出され、健全樹の核酸試料ではシグナルが検出されなかった。
  • ASSVd感染樹「印度」の樹皮、葉柄、葉、果実を用い、検出を行ったところ、いずれも高感度の検出が可能であったが、果実からの核酸試料でやや感度が劣った(図1)。
  • 9分離株を用い、葉及び樹皮から核酸試料を抽出し、ASSVdの検出を行ったところ、樹皮から抽出された核酸試料では、いずれの分離株も高感度で検出されたが、葉から抽出した核酸試料では分離株により差が認められた(図2)。

成果の活用面・留意点

分離株あるいはリンゴ品種が異なると、葉から抽出した核酸試料では検出感度に差を生じる場合があるので(図2)、信頼性の高い結果を得るには、材料として樹皮を用いる必要がある。

具体的データ

図1 DIG標識RNAプローブによるASSVd感染リンゴ樹の各部位からの抽出核酸希釈液におけるASSVdの検出

図2 DIG標識RNAプローブによるASSVdの9分離株の検出

その他

  • 研究課題名:リンゴ接ぎ木伝染性病害の病原究明ならびに迅速診断法の開発
  • 予算区分 :経常
  • 研究期間 :平成8年度(平成6年～10年)
  • 発表論文 :DIG標識RNAプローブによるリンゴ樹内のリンゴさび果ウイロイドの検出、
                    北日本病虫研報、1996。