プロテアーゼ生産性Bacillus属細菌の16S rDNAの制限酵素切断部位に基づく同定

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要約

ユニバーサルプライマーで増幅した16S rDNAの制限酵素切断部位(Hae III, Cfo I, Alu I)の相違により、耕地土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌は種或いは近縁種のレベルで同定できる。

• 担当:九州農業試験場・生産環境部・土壌微生物研究室
• 連絡先:096-242-1150   
• 部会名:総合農業(生産環境)、農業環境(農業生態)、生産環境   
• 専門:土壌
• 分類:研究

背景・ねらい

現在まで土壌の物質循環と微生物生態との関係解明を目的として、土壌プロテアーゼの生産に重要な役割を果たす多数のBacillus属細菌を分離してきている。近年Bacillus属細菌の分類は16S rDNAの可変領域の塩基配列により見直されてきている。よって、この領域の相違を反映する制限酵素切断部位を検索し、これらの制限酵素切断部位の相違に基づいたプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌の同定手法を開発する。

成果の内容・特徴

• データベースに登録されている16S rDNAの塩基配列から推定したBacillus属細菌(19種;31株)は制限酵素切断部位(HaeIII,CfoI,AluI)の相違により、16グループに分類できる(図1)。
• ユニバーサルプライマーを用いて増幅した対照菌株(9株)と、水田土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌(12株)の16S rDNA(22-1085bp)を、制限酵素で切断し、デンシトグラムで求めた断片長をもとに推定した切断部位は、データベースから推定した切断部位とほぼ一致した(表1)。そこでこの手法は同定手法として利用できる。
• この手法によって新たに畑土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌(11株)は制限酵素切断部位から、B.subtilisグループ(U80:(2)*)、B.cereusグループ(N4,N3,N7,N9,N68,U44,U72:(9),(9)**)、B.sphaericus(N63,N80,U77:(14)***)と同定され(表1)、結果は簡単な生理試験による結果と一致した。
  
  以上の結果から16S rDNAの制限酵素切断パターンによる分類はBacillus属細菌の簡易な同定手法として有効である。

成果の活用面・留意点

• 土壌から分離したBacillus属細菌のみではなく、形態学的グループ1群及び3群に属する一般的なBacillus属細菌の分類/同定にも適用できる。
• 類縁種であるB.subtilisグループ、B.cereusグループ内の分類は本法ではできない。
• デンシトグラムで求めた切断長から推定した切断部位はデータベースから決定した切断部位と1、2箇所のAlu I部位の違いが見られる場合がある。

具体的データ

その他

• 研究課題名:バイオマス窒素の代謝関連微生物活性の動態
• 予算区分:一般別枠(物質循環)
• 研究期間:平成9年度(平成4～10年)