セロビオースフォスフォリラーゼを活用した新規糖質の酵素合成

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要約

Cellvibrio gilvus由来のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を大腸菌で多量発現させた。得られた酵素を活用し、新規な糖質、6種類を合成した。本酵素反応では、副生成物がほとんど認められないという利点がある。

• 担当:食品総合研究所・応用微生物部・酵素利用研究室
• 代表連絡先:0298-38-8071
• 部会名:食品
• 専門:バイテク
• 対象:
• 分類:研究

背景

糖質の分解は容易であるが、合成は非常に困難である。有機溶媒存在下や、高濃度糖質存在下で分解酵素の糖転移活性を活用し、糖質を合成することも可能であるが、副生成物から分離精製が大変である。そこで、フォスフォリラーゼに着目し、各種糖質を酵素合成することとした。セロビオースフォスフォリラーゼは、これ まで、2件の遺伝子だけが登録されているにすぎないことから、Cellvibrio gilvus由来の本遺伝子のクローニングを実施し、本酵素を多量生産し、活用することとした。

成果の内容・特徴

• Cellvibrio gilvus由来のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子をクローニングし、本酵素の大腸菌における多量発現に成功した。
• 本酵素は、α-グルコース-1-リン酸をドナー、グルコースをアクセプターとし、セロビオースの合成を、あるいは、この逆反応であるセロビオースの加リン酸分解を触媒する酵素である。
• アクセプターとしての糖は、グルコース以外の糖でもかまわないことが判明した。
• 本酵素は、アクセプターであるグルコースのC2位、C6位で認識が甘く、グルコサミン、マンノース、マンノサミン、キシロース等の糖がアクセプターとなることを明らかにした。
• グルコースのC3位のOH基は厳密に認識していた。しかし、C2位とC3位のOH基がともにaxialであればアクセプターとなりうることが判明し、図1に示した3種の新規ヘテロ2糖類を合成し、その構造をFAB-MS及びNMRで確認した。
• C6位に関しては、電荷を持たなければ、非常にバルキーなものであってもアクセプターとなり得る。しかし、電荷を有する、グルコース-6リン酸、グルクロン酸はアクセプターとならない。
• 単糖以外に、1→6結合した2糖もアクセプターとなり、図2に示した、分岐構造を持つ新規な3糖類を合成した。また、その構造をFAB-MS及びNMRで確認した。
• 1→1、1→2、1→3、1→4結合の2糖類は、いずれもアクセプターとならない。

成果の活用面・留意点

• 市販されているシュークロースフォスフォリラーゼを活用し、砂糖に作用させれば、α-グルコース-1-リン酸が容易に調製できることから、原料の制約はない。
• セロビオースフォスフォリラーゼ反応は非常に厳密であり、β1→4結合以外の副生成物は検出されなかった。

具体的データ

その他

• 研究課題名:セロオリゴ等の遺伝子
• 予算区分:バイテク(糖鎖工学)
• 研究期間:平成10年度(平成7～12年)
• 研究担当者:林 清
• 発表論文等:1)Synthesis of β-D-glucopyranosyl-(1-4)-D-arabinose, β-D-glucopyranosyl-(1-4)-L-fucose and β-D-glucopyranosyl-(1-4)-D-altorose catalysed by cellobiose phosphorylase form Cellvibrio gilvus, Carbohydrate Research, 305, 543-548 (1998).
                    2)Acceptor specificity of cellobiose phosphorylase from Cellvibrio gilvus: synthesis of three branched trisaccharides, Carbohydrate Research, 308, 423-429 (1998).
                    3)Cloning, Sequencing and Expression of Cellobiose Phosphorylase gene from Cellvibrio gilvus. Journal of Fermentation and Bioengineering, 85, 511-513 (1998).