豚インターロイキン18に対するモノクローナル抗体の作出とその利用

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要約

豚インターロイキン18(IL-18)と特異的に結合する抗豚IL-18モノクローナル抗体を作製した。また,ウェスタンブロット法,サンドウィッチELISA法および免疫組織化学染色法による ,豚IL-18の検出が可能であること,およびイムノアフィニティーカラムによる豚IL-18の精製が可能であることを明らかにした。

  • キーワード:豚,インターロイキン18,モノクローナル抗体,サンドウィッチELISA
  • 担当:動衛研・免疫研究部・免疫機構研究室
  • 連絡先:0298-38-7857
  • 区分:動物衛生
  • 分類:技術・普及

背景・ねらい

インターロイキン18(IL-18)は,主に活性化マクロファージや上皮細胞から産生され,T細胞やNK細胞からのインターフェロンγ(IFN-γ)の産生を誘導するサイトカインである。そのIFN-γ誘導という生理活性を利用して ,IFN-γ誘導剤,抗ウィルス剤,抗菌剤,抗腫瘍剤,免疫調節剤,ワクチンアジュバント等の多様な臨床応用が期待されている。
我々は,家畜での本サイトカインの利用を目的として,豚のIL-18遺伝子をクローニングした。その組換えタンパク質を昆虫細胞発現系にて発現し,抗豚IL-18モノクローナル抗体を作製して ,豚IL-18の精製および検出系を確立した。

成果の内容・特徴

  • 豚IL-18の遺伝子をクローニングし,バキュロウィルス・昆虫細胞発現系によりその組換えタンパク質を作製した。これを免疫したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合法により ,豚IL-18に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
  • 豚IL-18を特異的に認識する種々のサブクラスの計15クローンのモノクローナル抗体を得た(表1)。
  • このうち,クローン7-G-8を捕捉用抗体,ビオチン化したクローン5-C-5を検出用抗体に用いたサンドウィッチELISAにより,豚IL-18を検出限界約20pg/ml の高感度で検出できる系を開発した(図1)。
  • 図2に示すとおり,得られたモノクローナル抗体はウェスタンブロットによる豚IL-18の検出にも有効であった。また ,モノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティーカラム1ステップだけでバキュロウィルス発現系で作製した組換え豚IL-18を精製することが可能であった。
  • さらに,これらのモノクローナル抗体の1部は,免疫組織化学染色による豚IL-18の組織切片上での検出にも有用であった(図3AおよびB)。

成果の活用面・留意点

  • 豚のIL-18 に対するモノクローナル抗体の作製は世界で初めてであり,豚の種々の感染症における免疫応答の解析や豚の臓器をヒトに移植する異種移植の拒絶免疫反応の解析等に幅広く利用されるものと考えられる。
  • 特に,開発したサンドウィッチELISAは高感度で豚IL-18を検出可能であり,豚IL-18 ELISAキットとして市販される予定。
  • これらのモノクローナル抗体は特許を取得し,全世界における研究試薬としての販売に関するライセンス契約を海外2社のメーカーと締結した。

具体的データ

表1 作製した抗豚IL-18モノクローナル抗体

 

図1 サンドウィッチELISAによる豚IL-18の定量

 

図2 ウェスタンブロットによる豚IL-18の検出

 

図3 免疫組織化学染色による豚IL-18の検出(クローン12-c-12使用)

 

その他

  • 研究課題名:サイトカインによる豚の粘膜免疫系の調節技術の開発
  • 予算区分:交付金プロ(サイトカイン)
  • 研究期間:2000～2001年度
  • 研究担当者:宗田吉広,下地善弘,新井啓五,森 康行
  • 発表論文等:
    1)Muneta et al. (2000) J. Immunol. Methods 236:99-104.
    2)Muneta et al. (2000) J. Interferon Cytokine Res. 20:331-336.
    3)宗田ら 特許第3230220号 「ブタ由来インターロイキン18に対するモノクローナル抗体」
    4)抗体の販売権に関するライセンス契約2件(イギリスSerotec社,オーストリアMedSystem Diagnostic社)