パンデミック(H1N1)2009ウイルスと既存豚インフルエンザウイルスの迅速鑑別法

要約

新しく構築したリアルタイムPCRは豚から分離される可能性があるパンデミック(H1N1)2009、古典的豚H1、欧州鳥型豚H1、人型H1およびH3、鳥型H9亜型のインフルエンザウイルスHA遺伝子を各々迅速に判別できる。

• キーワード:新型インフルエンザ、豚インフルエンザ、リアルタイムPCR、迅速診断
• 担当:動物衛生研・人獣感染症研究チーム
• 代表連絡先:電話029-838-7708
• 区分:動物衛生
• 分類:技術・普及

背景・ねらい

人におけるパンデミック(H1N1)2009(H1N1pdm)の流行の拡大によって、人から豚などの家畜に同ウイルスの感染が広がりつつある。現在豚からはH1N1pdmウイルスの他にも、従来から豚で循環している古典的豚H1、欧州鳥型豚H1、人型H1、H3および鳥型H9亜型ウイルスが分離される可能性が考えられる。豚から分離されたインフルエンザウイルスがH1N1pdmウイルスであるか、従来型の豚インフルエンザウイルスであるかを識別することは、H1N1pdmの豚から人への再感染を防止するなどの防疫対応上重要である。公衆衛生分野で用いられているH1N1pdmウイルスを検出するリアルタイムPCRは、H1N1pdmウイルスとヒト季節性インフルエンザのソ連型(H1亜型)との識別を目的としているため、赤血球凝集素(HA)遺伝子が同じ系統に属するH1N1pdmとH1亜型古典的豚インフルエンザウイルスとの識別が不可能である。本研究の目的は豚から分離されたA型インフルエンザウイルスのHA遺伝子が、H1N1pdmウイルス由来か、その他の従来型の豚インフルエンザウイルスに由来するものなのかを迅速に判別できるリアルタイムPCRを構築することである。

成果の内容・特徴

• 検出用プローブ、プライマーセットの特異性
  H1N1pdm、古典的豚H1、欧州鳥型豚H1、人型H1、人型H3および鳥型H9検出用プローブ、プライマーセットはそれぞれの系統・亜型だけを検出する(表1、2)。
• 検出用プローブ、プライマーセットの感度
  H1N1pdm、古典的豚H1、欧州鳥型豚H1、人型H1、人型H3および鳥型H9検出用プローブ、プライマーセットの検出感度は、反応液中においてそれぞれ10^-1.5～10^0.5、10^-1.5～10^2.6、10^1.6、10^-1.2～10^0.2、10^-0.7～10^0.2、10^1.0～10^1.2 EID₅₀またはTCID₅₀であり、これまで報告されているUSDAやCDC、市販のH1N1pdm検出用プローブ、プライマーセットと同等の感度を有している(表3)。

成果の活用面・留意点

• 豚から分離されたインフルエンザウイルスがH1N1pdmウイルスであるか、従来型の豚インフルエンザウイルスであるかを迅速に識別できる。このため、分離された豚インフルエンザウイルスについて、動衛研での使用と海外共同研究先への普及をしていきたいと考えている。
• 欧州由来鳥型豚H1、人型H1インフルエンザウイルス検出用プローブ、プライマーセットにおいて、リアルタイムPCR機器(Applied Biosystems 7500)を用いた場合、反応液中のウイルスRNA量が多いと増幅曲線の立ち上がりサイクルが早く、データ解析において自動解析では検出されない場合があることから、マニュアルベースライン(サイクル数:3～10)の設定が必要である。
• インフルエンザウイルスのHA遺伝子は塩基置換の蓄積が予想されることから、プローブ、プライマーセットの定期的な更新が必要である。

具体的データ

その他

• 研究課題名:新興・再興人獣共通感染症病原体の検出及び感染防除技術の開発
• 中課題整理番号:322a
• 予算区分:基盤
• 研究期間:2005～2009年度
• 研究担当者:廣本靖明、内田裕子、竹前喜洋、林豪士、津田知幸、西藤岳彦
• 発表論文等:1) Hiromoto et al. (2010) J. Virol. Methods. 170 (1-2): 169-172