ヨーロッパ腐蛆病菌用遺伝子発現ベクターの開発と形質転換法の確立

要約

ヨーロッパ腐蛆病の原因菌であるMelissococcus plutonius 用の遺伝子発現ベクターpMX2を開発し、それを菌株に導入するための形質転換法を確立した。これにより、M. plutonius の遺伝子操作が可能となり、本菌の研究の飛躍的な進展が期待できる。

• キーワード:ヨーロッパ腐蛆病、Melissococcus plutonius、形質転換、pMX2
• 担当:家畜疾病防除・細菌・寄生虫感染症
• 代表連絡先:電話 029-838-7708 (情報広報課)
• 研究所名:動物衛生研究所・細菌・寄生虫研究領域
• 分類:研究成果情報

背景・ねらい

ヨーロッパ腐蛆病はミツバチに無蓋蜂児の死亡を引き起こす感染症で、家畜伝染病予防法において法定伝染病に指定されている。原因菌のヨーロッパ腐蛆病菌(Melissococcus plutonius)は、約100年前からその存在が知られているものの、病原因子に関する情報は全くなく、本病の発病メカニズムについてもほとんど明らかになっていない。また、本菌では遺伝子操作法が確立されておらず、そのこともM. plutonius 研究の進展の障害となっていた。そこで本研究では、M. plutonius に利用可能な遺伝子発現ベクターを開発し、それを菌株に導入するための形質転換法の確立を行う。

成果の内容・特徴

• 豚レンサ球菌(Streptococcus suis)が保有する小型プラスミドを基に、マルチクローニングサイト、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)、S. suis のmalXプロモーターを保有するM. plutonius 内で複製可能な遺伝子発現ベクターpMX2を構築した(図1A)。
• pMX2は、表1に示すM. plutonius に最適化された方法で本菌に導入した場合、プラスミドDNA 1μg あたり平均1.76 x 10³個の形質転換体を得ることが出来る。
• 本プラスミドベクターは広宿主域の複製開始点を保有するため、M. plutonius だけでなく、大腸菌内でも複製が可能である。また、自身のプロモーターが含まれていない遺伝子断片であっても、クローニングサイト上流のmalXプロモーターと順向きに挿入すれば、M. plutonius 内でクローニングした遺伝子を発現させることが出来る(図1B)。

成果の活用面・留意点

• 本研究の結果、M. plutonius に遺伝子を導入し、M. plutonius 内で遺伝子機能を調べることがはじめて可能となった。これらを利用することによって、今後、未だ謎の多い本菌の生理機能や病原因子についての研究が飛躍的に進むことが期待できる。
• 作出したpMX2は適切な手続きを踏んだ上で分与可能である。
• pMX2はローリングサークル(RC)型機構と呼ばれる方法で複製をするプラスミドである。RC型機構でのプラスミドの複製には、宿主のRecA蛋白質の助けが必要であることが知られている。従って、大腸菌内でpMX2を安定に維持するためには、recA遺伝子に変異がない大腸菌株を宿主として使用する必要がある。

具体的データ

その他

• 中課題名:細菌・寄生虫感染症成立の分子基盤の解明と診断・防除のための基盤技術の開発
• 中課題整理番号:170a2
• 予算区分:科研費
• 研究期間:2010?2012年度
• 研究担当者:高松大輔、荒井理恵(埼玉県)、秋山 徹(国際医療研究センター)、奥村香世(帯畜大)、大倉正稔、切替照雄(国際医療研究センター)、小島温子(兵庫県)、大崎慎人
• 発表論文等:Takamatsu D. et al. (2013) Appl. Environ. Microbiol. 79(12):3882-3886