動物遺伝資源の特性評価のためのマイクロサテライトDNAの効率的単離法

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要約

動物遺伝資源の特性評価に資するため、マイクロサテライトDNAのゲノム中コピー数が少ない家禽において、pCR-Scriptべクター、点変異導入法および mung bean ヌクレアーゼを組み合わせることによってその効率的単離法を開発した。

• 担当:農業生物資源研究所・遺伝資源第一部・動物探索評価研究チーム
• 連絡先:0298-38-7041
• 部会名:生物資源畜産
• 専門:遺伝資源育種・遺伝
• 対象:家禽類家禽類
• 分類:研究研究

背景・ねらい

マイクロサテライトDNAは、数塩基の配列が繰り返しているもので、その代表としてCAリピートがある。マイクロサテライトDNAは、各染色体に広く分布し、対立遺伝子(a1lele)数が多いことから遺伝子マーカーとして哺乳動物の遺伝解析に広く用いられている。ところが家禽においては、既知のマイクロサテライトDNAマーカーは少ない。また、家禽のマイクロサテライトDNAの1ゲノムあたりのコピー数は、哺乳動物の約10分の1と少なく、従来法では新たなマイクロサテライトDNAのクローニングにかなりの時間と労力を要する。本研究では、マイクロサテライトDNAを応用した動物遺伝資源の遺伝特性評価に資するため、マイクロサテライトDNAの効率的なクローニング法を開発する。

成果の内容・特徴

• 点変異導入法(Kunkelら、1988)の操作手順を哺乳動物のマイクロサテライトDNAのクローニングに応用した方法(Ostranderら、1992)を改変し、家禽のマイクロサテライトDNAの効率的なクローニング法を開発した(図1)。
• この方法を用いた場合、表1のようにOstranderらの方法をそのまま家禽に応用した場合より、30倍以上効率的にマイクロサテライトDNAを単離できる。
• この方法では、PCR産物クローニング用に開発されたプラスミドベクターpCR-Script(Stratagene)を使用することにより、脱リン酸化処理を施したDNA断片のクローニング効率を上げ、さらに大腸菌XL1-B1ueMRF’を使用することによって形質転換効率を上げた。これによって、プライマー伸長反応に供与するクローン数を飛躍的に増加させた。
• CAリピートを含むクローンを選択する目的で、調製した一本鎖DNA、(CA)10オリゴヌクレオチド、dNTP、耐熱性ポリメラーゼを混合し、高温下でプライマー伸長反応を行った。その後、一本鎖DNA特異的分解酵素であるmungbeanヌクレアーゼを作用させることで、二本鎖DNAの効率的な選別を可能とした。
  (図2)

成果の活用面・留意点

本法は、すべての動物種においてマイクロサテライトDNAの効率的クローニング法として応用できる。

その他

• 研究課題名:動物遺伝資源評価のためのDNA多型マーカーの開発
• 予算区分:経常
• 研究期間:平成7年度(平成6～8年度)
• 発表論文等:
  1)Takahashi et al. :An efficient method to clone chiken microsaTellite repeat sequences.Japanese poultry science in press.
  2)Takahashi et al. Efficient cloning method to detect microsaTellite markers in chikens.
  第20回ベルツビルシンポジウム講演要旨p32,1995
  3)高橋ら:多型DNAマーカーの効率的クローニング法の検討。日本畜産学会大会講演要旨p177,1995
  4)高橋ら:ニワトリのマイクロサテライトDNAマーカー単離の効率化
  平成7年度日本家禽学会秋季大講演要旨p11,1995