時間分解蛍光測定による牛血中ホルモンの高感度測定法

※アーカイブの成果情報は、発表されてから年数が経っており、情報が古くなっております。
同一分野の研究については、なるべく新しい情報を検索ください。

要約

血中ホルモン微量免疫測定法を開発するため、標識物質としてランタノイド系蛍光物質であるユーロピウム(Eu)を用い時間分解蛍光測定法(TR-FIA) について検討した。本法により牛の血中LH、FSH、インヒビン、プロジェステロンおよびエストラジオールの測定が可能であった。

  • 担当:畜産試験場 繁殖部 生殖内分泌研究室
  • 連絡先:0298-38-8633
  • 部会名:畜産
  • 専門:繁殖
  • 対象:乳用牛肉用牛
  • 分類:研究

背景・ねらい

血中ホルモンの測定は、内分泌機能の解析や生殖器の疾病診断に欠かせない技術である。現在用いられている測定法にはラジオイムノアッセイ(RIA)法や酵素免疫測定法(EIA)がある。、RIA法は優れた方法であるが、放射性同位元素を用いるため使用施設が限定される。また、EIA法は精度や標識が巨大分子であるために免疫活性維持が困難である等の欠点がある。本研究では、低分子の非放射性蛍光物質(Eu)を用いRIA法と同等の感度・精度を有する簡便な牛血中ホルモンの測定法について検討した。

成果の内容・特徴

  • 標識ホルモンの作製はEuとホルモンを混合、一晩撹拌した後、ゲルろ過で分離する。溶出液の第一相に標識ホルモンが認められる。
    測定操作は、まず、第二抗体を結合した96穴マイクロプレートに第一抗体、測定試料を分注、約2時間室温で静置する。Eu標識ホルモンを添加、約2時間静置、洗浄の後、増強試薬を分注、時間分解蛍光測定装置(Wallac)で蛍光強度を測定する。試料分注から測定までの所要時間はマイクロプレート当たり約6時間である(図1)。
  • インヒビンの2サイト法は、第二抗体に換え抗βAサブユニット抗体を固相化し、標識した抗αサブユニット抗体を加える方法で行う。他の手技は上記の方法に準じた。
  • TR-FIA法により牛血中のプロジェステロン(P4)、エストラジオール、インヒビン、FSHおよびLHの測定が可能である(表1)。
  • P4のTR-FIA法による測定値は、RIA法で得られた測定値と高い相関(図2)を示し、回帰式はy=1.47x-0.25、 (r=0.977)であった。 以上のことからEu標識ホルモンを用いたTR-FIA法はRIA法と同様に牛血中ホルモンを測定できることが明らかとなった。

成果の活用面・留意点

放射性同位元素を用いることなく牛血中のホルモンが測定できる。しかし、牛血液に含まれる干渉物質の本質は解明できなかった。それ故、血液成分の干渉作用排除法の開発が安定した測定法の確立のために必要である。

具体的データ

図1.TR-FIA法の手順概略

表1.TR-FIA法によるウシ血中ホルモン測定法

図2.TR-FIA法とRIA法によるP4測定値の比較

その他

  • 研究課題名:ウシの発情・排卵時刻判定微量免疫測定キットの開発
  • 予算区分:官民共同
  • 研究期間:平成9年度(平成7年～9年度)
  • 発表論文等:
    1)ランタノイド蛍光物質を利用したウシ血中ホルモン測定法の検討 第91回日本畜産学会大会講演要旨 P201 (1996)
    2)Determination of plasma progesterone levels by the time-resolved fluoroimmunoassay(TR-FIA) during early gestation in cows.The 8th AAAP Anim. Sci. Cong. Proc. Vol 2  94-95 (1996)
    3)繰り返し過剰排卵処置された黒毛和種の生殖機能  第90回日本繁殖生物学会講演要旨 P113 (1996)
    4)ウシの発情前後の血中性腺刺激ホルモン、インヒビンの消長 第94回日本畜産学会大会講演要旨 P130 (1998)