マイクロドロップレット法を用いたウシ卵割期胚の凍結保存

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要約

ウシ卵割期胚をマイクロドロップレット法により凍結保存することによって,従来のストローを用いる方法に比べて融解後の高い生存率と体外培養後の高い発生率が得られる。

  • 担当: 畜産試験場 繁殖部 生殖細胞研究室
  • 連絡先:0298-38-8635
  • 部会名:畜産
  • 専門:繁殖
  • 対象: 乳用牛・肉用牛
  • 分類:普及

背景・ねらい

受精卵クローン牛作出における,核移植のドナー核提供の素材となるウシ卵割期胚(8?32細胞期胚)は,従来の凍結保存方法では凍結融解後の生存性が著しく低かった。 そこで,本研究では冷却・融解速度を速めたマイクロドロップレット法を用いて,ウシ卵割期胚の新たな凍結保存方法を確立する。

成果の内容・特徴

  • 体外受精後3日で8?16細胞期に発育したウシ胚を,前平衡無し(0%)、或いは1、2%のエチレングリコール(EG)溶液に37℃で12?16分間浸し,次にガラス化液(5.5M EG + 1.0 M シュークロース)に37℃で1分間平衡させて液体窒素中に投入した。マイクロドロップレット法(MD法: 図1)では,胚を少量(4?8μl)のガラス化液とともに液体窒素中に直接滴下し,ストロー法(S法)では,胚を0.25mlのプラスティックストローに充填してから冷却を行った。胚を融解後 (図2),144時間培養し,胚盤胞及び脱出胚盤胞への発生率を調べた。
  • その結果,2% のEGで前平衡した場合,MD法はS法よりも胚盤胞への発生率が有意に高く,凍結していない胚と差が認められなかった(p<0.05: 表1)。このことにより,ウシ卵割期胚の凍結保存においてMD法は極めて有効な方法であることが示された。

成果の活用面・留意点

核移植のドナー細胞となるウシ卵割期胚の凍結保存が可能になったことにより,受精卵クローン牛の作出がより効率的に行えるようになる。

具体的データ

図1 マイクロドロップレット法による胚の保存方法

 

表1 ウシ体外受精3日目胚の保存後の発生率

 

図2 融解直後のウシ3日目胚

その他

  • 研究課題名: 卵割期胚および顕微操作胚の凍結保存技術の確立
  • 予算区分: 畜産対応研究[繁殖技術]
  • 研究期間: 平成12年度(平成7～12年度)
  • 研究担当者: 志水 学,Krzysztof Papis,Saha Sukumar,居在家義昭,下司雅也
  • 発表論文等: A highly efficient modified vitrification method, for day 3 in vitro produced bovine embryos. Cryo-Letters, 20, p203-206 (1999)
  • 特許:細胞の凍結保存方法、特許第3044323号(2000)