無血清培地によるウシ卵子の体外成熟および体外受精卵の培養法

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要約

ウシ未成熟卵胞卵子を卵胞刺激ホルモン添加TCM199培地で成熟培養後、ヘパリン処理精子を用いて媒精、低酸素分圧下でCR1aa培地を用いて培養することにより、 血清を用いない非共培養系でのウシ胚盤胞の生産が可能である。

  • 担当:東北農試・畜産部・家畜繁殖研
  • 連絡先:019-643-3542
  • 部会名:畜産(家畜)
  • 専門:繁殖
  • 対象:家畜類
  • 分類:研究

背景・ねらい

ウシ胚を得る方法の一つとして体外受精技術が開発れ、 実用化技術として確立されつつある。しかしながら、 今日においても未成熟卵の成熟及び受精卵の胚盤胞への発生が 安定して行われるまでには至っておらず、 その要因の一つとして培地への添加血清の品質の不安定性があげられる。 また、伝染病等の予防の観点からも 無血清培地による卵子及び受精卵の培養は不可欠であると考えられる。 そこで、培養液の組成や培養条件を検討し、 未成熟卵の成熟から胚盤胞までの発生を維持できる 無血清培地による体外培養系を開発した。

成果の内容・特徴

  • ウシ未成熟卵胞卵子を血清添加あるいは無添加のTCM199(卵胞刺激ホルモン添加) を用いて成熟培養を行った場合、成熟培地への血清添加の有無にかかわらず、 成熟率及び胚盤胞への発生率に差は認められなかった(表1)。
  • 発生用培地の基本培地としてTCM199とCR1aaを比較した場合、 卵丘細胞と共培養条件では差は認められなかったが、 非共培養系ではCR1aaを用いた場合の方が有意に胚盤胞への発生率が高まった(表2)。
  • 体外成熟・体外受精後のウシ卵子をCR1aa培地(媒精5日目よりグルコース添加) を用いて培養した場合、培養気相中の酸素分圧を20%から5%へ下げることにより、 胚盤胞への発生率を高めることができた。ただし、 CR1aaのウシ血清アルブミンをポリビニルアルコールに置き換えた場合には、 胚盤胞への発生は認められなかった(表3)。

成果の活用面・留意点

血清を用いない非共培養系でのウシ胚盤胞の作出が可能である。 ただし、本方法においてもウシ血清アルブミンの添加は必要で、 今後、完全合成培地による培養系の開発が必要である。

具体的データ

表1 成熟培地への血清添加の有無が成熟及び発生に及ぼす影響

表2 発生用基本培地の違いおよび細胞の有無が牛体外成熟・受精卵の発生に及ぼす影響

表3 培地気相中の酸素分圧が非共培養系での牛体外受精卵の発生に及ぼす影響

その他

  • 研究課題名:無血清培地による初期胚の体外培養系の開発
  • 予算区分 :経常
  • 研究期間 :平成5年度～7年度
  • 発表論文等:ウシ体外成熟・受精卵の無血清培養の試み
                      日本畜産学会東北支部会報 43(2) : 60 (1993)
                      発生培地の違いが牛体外成熟・受精卵の初期発生に及ぼす影響
                      東北農業研究47:209-210(1994)
                      培養気相中の酸素分圧あるいは発生培地へのBSA添加の有無が
                      ウシ体外成熟・受精由来卵の胚盤胞への発生に及ぼす影響
                      東北畜産学会報46 (2): 46 (1996)