カンキツにおけるダイレクトPCR法

要約

カンキツの葉を突いた爪楊枝をPCR反応液に浸すことでダイレクトPCRを行うことができる。また、葉を突いた爪楊枝をTE0.2バッファーに浸すとDNAサンプルを作成することもできる。これにより、DNA抽出に要する時間、実験機器および消耗品類を大幅に削減できる。

  • キーワード:カンキツ、DNAマーカー分析、ダイレクトPCR、DNA抽出、爪楊枝
  • 担当:果樹・茶・カンキツ
  • 代表連絡先:電話 029-838-6453
  • 研究所名:果樹研究所・カンキツ研究領域
  • 分類:研究成果情報

背景・ねらい

近年、カンキツ育種実生の早期選抜や品種識別のためにDNAマーカーを用いる機会が増えてきた。しかしながら、分析には多くの時間がかかり、高額な機器や試薬等の消耗品が必要であった。特に木本植物のDNA抽出においては、多糖類やポリフェノールなどのPCR阻害物質を取り除くために多くの工程が必要であった。そこで本研究では、カンキツにおけるダイレクトPCR法の開発に取り組んだ。

成果の内容・特徴

  • 緑化直後のカンキツ葉を爪楊枝で突き刺し、それをPCR反応液に浸すことによりダイレクトPCRを行うことができる(図1)。また、葉を突いた爪楊枝をTE0.2バッファー(10 mM Tris-HCl pH 8.0 and 0.2 mM EDTA)に浸すことでPCRが可能なDNAサンプルを作成することもできる(超簡易DNA抽出法とする)。いずれの場合も、純度の低いDNAサンプルからのPCR増幅が可能な遺伝子増幅用試薬を用いる。
  • ダイレクトPCR法および超簡易DNA抽出法によるPCRの成功率は平均96%である(表1)。
  • これにより95サンプルのPCRを開始するまでに要する時間を1.5～2時間(2006年成果情報;簡易で迅速なカンキツのDNAマーカー分析法、の10分の1以下)に短縮できる(図1)。また、サンプル破砕装置、遠心機、ヒートブロックなどの高額な実験機器が不要で、DNA抽出に用いる試薬やプラスチック製品などの消耗品も節約できる。

成果の活用面・留意点

  • 育種実生の早期選抜、苗木や穂木の品種判別に用いられている。
  • 1つのDNAマーカーについて素早く結果を得たい場合にはダイレクトPCRを、複数のDNAマーカーの場合には超簡易DNA抽出法を行うと効率が良い。
  • DNA抽出に向いた健全な葉であれば、成葉や旧葉も利用できる。
  • この方法により比較的長い500-1200bpのDNAマーカーの増幅が可能である。
  • サンプルの採取時期や実験条件の検討を行うことにより、カンキツ以外の木本植物(クリ、マンゴー、ナシなど)でも利用可能である。

具体的データ

 図1,表1

その他

  • 中課題名:成熟期の異なる良食味カンキツ品種の育成と省力生産技術の開発
  • 中課題番号:142c0
  • 予算区分:交付金
  • 研究期間:2008～2012年度
  • 研究担当者:太田智、矢野加奈子(契約職員等)、栗田恭伸(愛知農試)、喜多正幸、清水徳朗、吉岡照高、根角博久
  • 発表論文等:1)Ohta et al. (2013) J. Japan. Soc. Hort. Sci. 82: 14-21